国标：蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇残留量的测定方法 .

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T 18932. 26-2005

蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇 残留量的测定方法 液相色谱法
Method for the determination of metronidazole, ronidazole and
              dimetridazole residues i n honey               

蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇          残留量的测定方法              液相色谱法
范围
    GB/T 18 9 32的本部分规定了蜂蜜中甲硝哒哇、洛硝哒哩、二甲硝咪哇残留量的液相色谱测定 方法 。 本部分适用于蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哩残留量的测定。 本部分的方法检出限: 甲硝哒4、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇均为。. 010 mg /kg.
2 规范性 引用文件
    下列文件中的条款通过 GB/丁1 89 32的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件， 其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本部分， 然而， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的版本。凡是不注日期的引用文件， 其版本适用于本
部分 。    GB/T 6 37 9 测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法 的重复性和再现性 ( GB/T 63 79 -19 86, neq I S O 57 25; 1 98 1)    GB/T 6 68 2 分析实验室用水规格和试验方法( GB/T 66 8 2-19 92, n eq I SO 369 6: 19 87)
3 原理
    试样中硝基咪哩类药物残留用乙酸乙醋提取， 提取液蒸干后， 用水溶解， 经过 Oas i s HLB固相萃取 柱和BAKERBOND Carboxylic Acid固相萃取柱净化， 液相色谱仪紫外检测器测定， 外标法定量。
4 试剂和材料
    除另有说明外， 所用试剂均为分析纯， 水为GB/T 6 68 2规定的一级水。
4 .1 甲醇: 色谱纯。 42 乙睛: 色谱纯。 4 .3 乙酸乙醋: 色谱纯。 4 .4 无水乙酸钠: 分析纯。 4 .5 bing乙酸: 优级纯。 4 .6 甲醇十水( (5 +95) : 量取 5 mL甲醇与 95 mL水混合。 4 .7 乙酸盐缓冲溶液; 0.82 g/ L。称取 0. 8 2 g无水乙酸钠， 用 8 00 ml 一水溶解， 用bing乙酸调节 pH至
4.3，用水稀释至 1 L, 4 .8 洗脱剂:甲醇+乙睛+乙酸盐缓冲溶液( 40+6+54) . 4 .9  Oasis HLB固相萃取柱或相当者: 5 00 mg,6 mL。使用前分别用5 mL甲醇和 10 mL水预处理， 保持柱体湿润。 4 . 1 0 BAKERBOND Carboxylic Acid固相萃取柱或相当者: 5 0 0 mg,3 mL。使用前用 5 mL乙酸乙酷 预处理， 保持柱体湿润。

4.1 1 甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇标准物质: 纯度)9 8%. 4.1 2 甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇标准储备溶液: 1. 0 mg/ mL。准确称取适量的甲硝哒哇、 洛硝 哒哇、 二甲硝咪哇标准物质， 分别用甲醇配成 1. 0 mg/ mL的标准储备液。储备液可在温度低于 4℃冰
箱中保存二个月。 4.1 3 甲硝哒哗、 洛硝哒哩、 二甲硝咪哇混合标准工作溶液: 根据需要吸取适量甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二 甲硝咪哇标准储备溶液， 用流动相稀释成适当浓度的混合标准工作溶液， 混合标准工作溶液应现用
现配 。
5 仪器
5. 1 液相色谱仪: 配有紫外检测器。 5. 2 分析天平: 感量。. 1 mg和0. 01 g各一台。 5. 3 液体混匀器。 5. 4 固相萃取真空装置 5. 5 振荡器。 5. 6 具塞玻璃离心管: 5 0 ml , . 5. 7 真空泵: 真空度应达到80 kPa, 5. 8 离心机。 5.9 旋转蒸发器。 5. 1 0 样品管:5 mL.
5. 11  pH计 : 测量精度士0.0 2. 5. 12 梨形瓶 :200 ml 
6 试样的制备与保存
3 .1 试样的制备    对无结晶的实验室样品， 将其搅拌均匀。对有结晶的样品， 在密闭情况下， 置于不超过 6 0℃的水浴 中温热， 振荡， 待样品全部融化后搅匀， 迅速冷却至室温。分出。. 5 kg作为试样。制备好的试样置于样 品瓶中， 密封 ， 并做上标记。
5.2 试样保 存    将试样于常温下保存。
7 测定步 骤
7. 1 提取    称取 6g试样( 到 。. 01 g) 置于 50 MI具塞玻璃离心管中， 加人 6 mI 一水， 在液体混匀器上混 匀， 加 20 ml 一乙酸乙醋， 于振荡器上振荡 20 mi n， 离心， 取上清液至梨形瓶中。再用20 ml乙酸乙酷提 取一次， 合并上清液， 用旋转蒸发器于 45 ℃水浴上减压蒸发至干， 用 5 ml水溶解， 待净化。
7.2 净化    将上述 5 mL水溶液移至 Oas i s HLB柱中，以小于等于 3 mL/ mi n的流速通过 Oas i s固相萃取柱 后， 用 5 mL水洗涤梨形瓶 ， 移至 Oas i s HLB柱中洗柱， 再用 5 mL甲醇+水(4 .6)洗柱， 弃去全部流出 液。在 65 kPa的负压下， 减压抽干20 mi n， 将 Oa s i s HLB柱下接Carboxylic Acid固相萃取柱， 用 5 MI 乙酸乙醋以小于等于3 mL/mi n的流速洗脱 Oa s i s HLB柱并通过 Carboxylic Acid固相萃取柱， 弃去 Oa s i s HLB柱， 分别用 5 ml乙酸乙醋和 5 mL乙睛洗涤 Carboxylic Acid固相萃取柱， 弃去全部流出 液。在 65 kPa的负压下， 减压抽干5 mi n， 用 2m工 一洗脱剂( ( 4 .8) 洗脱， 收集洗脱液于 5 mL样品管中， 用洗脱剂定容至 2 mL， 供液相色谱仪测定。 7.3 测定 7. 3.1 液相色谱条件    a )色谱柱: Di a mo ns i l C, a , 5 pm, 250 mmX4.6 mm( 内径) 或相当者;    b)流动相: 乙睛+乙酸盐缓冲溶液(1 0+9 0) ;    c)流速 :1. 0 mI ./mi n;    d)柱 温 : 250 C;    e )进样量: 5 0 KL;    f )检测波长: 315 nmo

7.3.2 液相色谱测定    用甲硝哒哇、 洛硝哒噢、 二甲硝咪哩混合标准溶液分别进样， 以峰面积为纵坐标， 工作溶液浓度为横 坐标绘制标准工作曲线， 用标准工作曲线对样品进行定量， 样品溶液中甲硝哒哩、 洛硝哒哩、 二甲硝咪哇 的响应值均应在仪器测定的线性范围内。甲硝哒哇、 洛硝哒哇、二甲硝咪哇标准物质色谱图参见 图 A.1。 在上述色谱条件下， 甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇的参考保留时间见表 1,                      表 1 甲硝哒哇、 洛硝哒哩、 二甲硝咪哇的参考保留时间            硝基咪哇类药物名称 } 保留时间/ f l i 。 } 二 FP M r A qm m w A qE p A V * u t二牛 本方法的添加 回收率数据参见 附录 Bo  平行试验
按 以上步骤 ， 对 同一试 样进行平行试验测定 。  空 白试验
除不称取试样外 ， 均按 上述步骤同时完成空 白试验 。
1 s. o
7.5
结果计算
结果按式( 1) 计算:
1 0 0 0 1 0 0 0 (1)
V一m
    C
  一 一  X
式 中: X- 试样中被测组分残留量， 单位为毫克每千克( mg/ kg); 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度， 单位为微克每毫升( Rg/ mL) ; 样品溶液终定容体积， 单位为毫升( mL) ; m— 样品溶液所代表终试样的质量， 单位为克( 9) 。
注 :计算结果 应扣除空白值
9 精密度
    本部分的精密度数据是按照GB/T 6 37 9的规定确定的， 重复性和再现性的值以 9 5%的可信度来 计算 。 9 .1 重复性    在重复性条件下， 获得的两次独立测试结果的差值不超过重复性限( r )， 蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝 哒哇、 二甲硝咪哩含量范围及重复性方程见表 2,

表 2 含t范 围及重 复性 和再现性方程
名 称 含量范围八mg/kg) 重复性 限 r 再现性 R
甲硝哒哇 0. 010^-0. 100 r=0. 030 3 m+2. 167 3 R=0.080 7 m+1. 040 8
洛硝哒哇 0. 010 0. 100 r =0.060 8 m+1. 872 7 R=0.062 0 m十1. 719 0
二甲硝咪哇 0. 010^0. 100 - 0.062 7 m+1. 441 1 I g R=O. 709 9 I g m-0. 437 7
注:。为两次测定结果的算术平均值。
    如果差值超过重复性限， 应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。
9. 2 再现性    在再现性条件下， 获得的两次独立测试结果的差值不超过再现性限( R)， 蜂蜜中甲硝哒哇、 洛 硝哒哇、 二甲硝咪哇的含量范围及再现性方程见表20

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